神经元特异性烯醇化酶检查过程

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神经元特异性烯醇化酶检查过程

本法分三个步骤,即抗原与抗体反应、B和F分离和放射性测定. (1)抗原与抗体反应:将标本(非标记抗原)、标记抗原和抗血清顺序定量加入小试管内,置室温(15～30℃)作用24h,使其充分竞争结合. (2)B、F分离:分离技术多种多样,常用沉淀法.①第二抗体沉淀法:又称双抗体法,在受检抗原与第一抗体特异性反应后加入相应的第二抗体,使形成的抗原-第一抗体-第二抗体的复合物共沉,一经离心即可使结合标记抗原B与游离抗原F分离.本法是特异性沉淀,分离完全,非特异性结合力低.但第二抗体用量较大,成本较高.此外血清浓度、抗凝剂的有无因素可在一定程度上影响结果.②聚乙二醇(PEG)沉淀法:使蛋白质处于等电点状态,水化层破坏而导致蛋白质沉淀.本法优点是PEG制备方便、价廉、分离快速,缺点是非特异沉淀物较多,分离不完全.③第二抗体-聚乙二醇沉淀法:本法既有PEG法的快速沉淀优点,且保持第二抗体特异性沉淀的作用,又减少第二抗体用量,并降低PEG浓度,使非特异沉淀物减少.④活性炭吸附法:利用活性炭表面活性将小分子的游离部分吸附.如在活性炭表面涂上一层葡聚糖,使它表面具有一定孔径的网眼,从而允许小分子游离抗原或半抗原逸入而被吸附,而大分子复合物则被排斥在外.在抗原与抗体反应后,加入葡聚糖-活性炭,放置5～10min,使游离抗原吸附在活性炭颗粒上,离心使颗粒沉淀,上清液中含有结合的标记抗原. (3)放射性强度测定:B和F分离后,即可测定其放射性强度.测量仪器有两类:液体闪烁计数仪(测β射线)和晶体闪烁计数仪(测γ射线).计数单位是探测器输出的电脉冲数,单位为cpm(脉冲数/min). 每次测定均需作一标准曲线图,以标准抗原的不同浓度为横坐标,以测到的相应放射性强度为纵坐标作图.放射性强度可任选B或F,亦可采用计算值B/BF、B/F或B/B0.标本应作双份测定,取其平均值,在标准曲线上查出相应的受检抗原浓度.

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